Sau quá trình tu học, Phó tế Giuse Nguyễn Thiện Khuyến được phong chức linh mục ngày 5 tháng 4 năm 1930 tại Phát Diệm. Sau khi được phong chức linh mục, tân linh mục Khuyến được bổ nhiệm đảm trách vai trò linh mục phó giáo xứ Khiết Kỷ, Ninh Bình. Sau ba năm đảm trách vị trí linh mục phó xứ, linh mục Khuyến được điều chuyển đảm nhận vai trò linh mục chánh xứ tiên khởi tân Giáo xứ Hoàng Mai, Ninh Bình.[3]

Từ năm 1939, nhiệm vụ của linh mục Nguyễn Thiện Khuyến là quản nhiệm giáo xứ Hiếu Thuận và ông đảm nhận vai trò này đến tận năm 1944. Từ năm 1944, ông đảm trách vai trò linh mục chánh xứ Ứng Luật vừa thành lập. Năm 1946, linh mục Nguyễn Thiện Khuyến được thuyên chuyển làm linh mục chính xứ giáo xứ Văn Hải và kể từ năm 1949 đảm nhận vai trò chính xứ Trì Chính. Trong thời gian ngắn từ năm 1953 đến năm 1954, ông đảm nhiệm vai trò linh mục Chánh xứ Giáo xứ Phúc Hải và từ năm 1954, ông là linh mục Chánh xứ Giáo xứ Hướng Đạo, Ninh Bình kiêm xứ Ứng Luật, Hòa Lạc, Phú Hậu. Từ năm 1966, ông còn kiêm nhiệm chức vụ linh mục quản nhiệm các giáo xứ khác như Tôn Đạo, Khiết Kỷ, Thuần Hậu.[3]

Năm 1974, linh mục Giuse Nguyễn Thiện Khuyến được bổ nhiệm làm linh mục Chánh xứ Nhà thờ chính tòa Giáo phận Phát Diệm và giữ tiếp tục đảm nhận việc quản nhiệm 7 giáo xứ ông đã quản nhiệm từ năm 1955. Ông quản nhiệm tất cả các giáo xứ này cho đến khi qua đời năm 1981.[3] Năm 1974 đến năm 1976, linh mục Khuyến là linh mục Tổng Đại diện Giáo phận Phát Diệm. Lý do ông đảm nhận vai trò này là giám mục Giuse Lê Quý Thanh vừa qua đời, trợ giúp giám mục Phaolô Bùi Chu Tạo đau buồn và già yếu.[4]